在高度片段化的RNA样本中鉴定lncRNA生物标记
优化NextSeq 500系统和TruSeq RNA Exome Kit的RNA测序工作流程来鉴定lncRNA生物标记。
在高度片段化的RNA样本中鉴定lncRNA生物标记
总结
概述
Biogazelle在FFPE和液体活检癌症样本中进行捕获RNA-Seq来鉴定lncRNA和mRNA突变。
挑战
FFPE和液体活检样本都有起始量非常低和RNA高度片段化的问题。
解决方案
Biogazelle选择了NextSeq 500系统和TruSeq RNA Exome Library Prep Kit。该公司与Illumina合作，优化了捕获RNA-Seq的工作流程，开发了定制探针，实现了独特的捕获过程。
优势
Biogazelle可以用几纳克的总RNA来进行准确、灵敏的lncRNA测量，即便对于FFPE和液体活检样本也仍然如此。
简介
对RNA数十年的痴迷使Jo Vandesompele教授在（PhD）在2007年创建了Biogazelle。该公司为制药、生物技术和临床研究人员提供转录组分析和实验设计服务。它的服务范围包括：通过定制RNA定量研究来发现和验证RNA生物标记；高通量反义寡核苷酸筛选；鉴定、测量和沉默长链非编码RNA（lncRNA）靶点；帮助客户进行先导药物发现和临床前研究。
非编码RNA研究是Biogazelle大部分肿瘤学工作的核心。某些癌细胞似乎依赖于特定lncRNA的存在，当该转录本被沉默时，它们就会死亡。1使用福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）样本和液体活检样本来进行分析是很困难的，因为这些癌症样本具有低起始量和高度片段化的特征。Biogazelle使用了NextSeq 500系统和TruSeq RNA Exome试剂盒来进行RNA-Seq，以便从这些样本中获得最多的信息。
Jo Vandesompele博士是根特大学的教授，也是Biogazelle的联合创始人兼首席科学官。
从高度片段化的样本中获得最多的信息。
Vandesompele教授认为，NextSeq 500系统是最好的RNA测序仪器。“它具有我们开展总RNA-Seq所需的容量、灵活性和规模，”Vandesompele教授说。“它还能支持各种文库类型。”
这些癌症样本极为珍贵。“我们的客户和合作伙伴不希望将生物材料牺牲在需要1 µg或100 ng RNA的方法上，”Vandesompele教授补充道。
Biogazelle与Illumina合作，降低了各种RNA-Seq应用所需的样本量。“我们在寻找多少样本才能成功进行RNA-Seq的答案，”Vandesompele教授说。“10 ng可以吗？1 ng呢？我们能对不能可靠地测量RNA浓度的液体活检样本测序吗？令人惊奇的是，要实现它们并不困难，只需进行一些简单而巧妙的改进。我们可以用几纳克的总RNA或者仅仅200 µL的生物液体来进行准确且灵敏的RNA测量。2我们非常感谢Illumina团队的支持，让我们能实现这一切。”
NextSeq 500系统"具有我们开展总RNA-Seq所需的容量、灵活性和规模。它还能支持各种文库类型。"
克服挑战
TruSeq RNA Exome Library Prep Kit是处理起始量非常低且RNA高度片段化的FFPE和液体活检样本的“优秀解决方案”。它能将总RNA转变为已知链起源的模板分子，然后进行目标外显子的序列捕获。“其他总RNA制备方法会在没有意义的内含子上消耗很多read，而且生成的数据质量也较低，”Vandesompele教授说。“基于RNA Exome探针的捕获方法非常优秀，就像魔法一样。”
RNA Exome唯一的限制是探针只靶向蛋白编码基因。“我们进行总RNA-Seq时，lncRNA几乎处于噪音水平，95%的read都属于高丰度的蛋白编码基因，”Vandesompele教授解释道。“为解决这一问题，Illumina使用了我们在根特大学创建的全面的人类LNCipedia数据库来开发靶向所有目标的定制探针。3用靶向这些具有挑战性的低丰度lncRNA的定制探针来补充试剂盒，帮助我们进行这不可思议的实验。它还开辟了许多新的可能性，能帮助我们的客户研究此前无法研究的内容，这非常棒。”
“基于RNA Exome探针的捕获方法非常优秀，就像魔法一样。”
改进针对低起始量样本的工作流程
TruSeq RNA Exome是处理低起始量样本的良好技术，在此基础上，Biogazelle还根据RNA分子改进了一些工作流程。“针对低RNA起始量，我们采用了许多不同的技巧，例如通过浓缩样本增加起始体积，”Vandesompele教授说。
Biogazelle团队发现，在使用TruSeq RNA Exome进行捕获前的多重化对液体活检样本来说是一个问题。“由于RNA的含量不同，我们的文库永远不会是等摩尔的，”Vandesompele教授补充道。“我们没有在捕获前多重化，而是对每个样本分别捕获。这需要进行更多的工作，但数据明显更好，而且文库是等摩尔的。”
“lncRNA为肿瘤学、神经学和其他疾病领域带来了希望。我们正在开始使用一种全新的药物。”
高价值的RNA-Seq肿瘤学研究
Vandesompele教授相信，RNA-Seq数据提供的信息量与DNA测序数据提供的一样多，甚至更加丰富。与21,000个蛋白编码基因相比，49,000个高置信度lncRNA基因明显具有更大的生物标记潜力。但是，它的价值也许体现在同时分析RNA和DNA特征来评估癌症或其他疾病。“lncRNA为肿瘤学、神经学和其他疾病领域带来了希望，”Vandesompele教授说道。“我们正在开始使用一种全新的药物。”
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参考文献
- Huarte M and Rinn JL.Large non-coding RNAs: missing links in cancer? Hum Mol Genet.2010;19:152-161.
- Biogazelle.Expertise/Liquid biopsies. www.biogazelle.com/expertise/liquid-biopsies.Accessed.June 17, 2019
- LNCipedia.A comprehensive compendium of human long non-coding RNAs.lncipedia.org/.Accessed May 28, 2019.